10-5. cDNAクローンの選択

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ゲノミックライブラリーのようにハイブリダイゼーションによる相同性クローニングもできるが、cDNAクローン最大の特徴はタンパク質が産生されることであり、それが選択にも利用できる

既知DNAとの間に配列上の類似性のない新規クローンの選択では、発現するタンパク質に基づく発現クローニング(発現選択法)が行われる

発現選択法のうち、生物機能を利用した方法を特に機能性クローニング(機能発現クローニング)という

1) 結合性に基づく発現クローニング

目的タンパク質の抗体があれば使える

このための代表的ベクターにλ gt11がある

ライブラリーを大腸菌に感染させてIPTG誘導してタンパク質を産生するプラークをつくる

次にメンブランフィルターを重ねてプラークのタンパク質を転写する

ウエスタンブロッティグの原理で一次、二次と抗体を順に反応させて、シグナルを検出する

組込まれたタンパク質コード領域は、3分の1の確率で(融合タンパク質と読み枠が合う確率で)ベクター由来のβ-gal融合タンパク質を発現する

細胞を使った、あるタンパク質に結合する未知タンパク質のクローンを検出するための方法で、レポーターアッセイを利用する

合成したcDNAを転写活性化領域かDNA結合領域のcDNAと融合させる形でベクターに組込み、酵母に導入し、酵母で働くマーカーや増殖性でクローンを選択する

パニング(panning)とは、金鉱山で泥水の仲の金の粒を比重によって土砂と分離して金を濃縮するという行為に充てられる用語

この方法ができるためには、クローン由来タンパク質が細胞表面に発現することが前提となる

R結合性タンパク質のcDNAを選択する場合、Rをあらかじめ付着させた容器にライブラリー由来タンパク質が発現している細胞集団を入れ、洗浄後に容器に付いた細胞を集め、細胞からベクターを回収する

操作を繰り返すことにより目的クローンを濃縮できる

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ファージディスプレイも同じ原理でクローンの選別・濃縮ができる

2) 機能性クローニング

例えば細胞死滅因子のcDNAを検索する場合、ライブラリーを分割し、各分割集団(プール)を細胞にトランスフェクションし、細胞死を高めるプールを決める

細胞を培養している培養液を他の細胞に与えてもよいし、抗体がある場合は抗体で検出してもよい

陽性プールを導入した細胞からDNAをベクターごと回収し、大腸菌で増やした後でさらに分割したプールをつくり、同じ解析を繰り返す

このような作業を何回か行うことにより、単一クローンが単離できる

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ただし、この選択法を使うためには、以下の条件が必要

単一クローン(タンパク質)で機能が発揮される

一過的発現で機能を測定することができる

ベクターからの発現が十分な量ある

目的遺伝子機能を検定できる適当な細胞や個体がある

Column 南西クローニング？

その遺伝子クローニングの大部分は、1980年代の半ばからの約10年間の間に実施された

精製タンパク質が大量にあればアミノ酸配列を決めてDNAプローブをつくることもでき、また抗体をつくることもできたであろうが、すべてがうまくいくわけでもなく、また現在のように超微量タンパク質からアミノ酸配列を決める技術もまだなかった時代

そういう状況で生まれたクローニング技術の一つが南西クローニング(サウスウエスタンクローニング)

サウス＝DNA、ウエスタン＝タンパク質

サウスウエスタン法から推定できるように、この方法はDNA結合性に基づいたクローニング法

まず、ファージcDNAライブラリーをプラークとしてシャーレ上に広げた後、タンパク質をフィルターに転写させる

次に、そこにタンパク質結合配列をもつ標識DNAをプローブとして当てる

あたかもDNAをハイブリダイゼーションで選択するような選択法を行うのである

ファージがタンパク質のDNA結合領域を発言してさえいれば、結合場所がスポットとしてX線フィルム上に浮かび上がってくるというしくみ